钙离子 (Ca²⁺) 作为重要的次级信号分子参与植物的生长发育及环境信号的应答。低温诱导的细胞膜固化可能被定位于细胞膜上的蛋白等感知，进而迅速诱导细胞质中Ca²⁺浓度增加，产生特异的Ca²⁺信号 (Ca²⁺ signature) (Ding et al., 2020; Liu et al., 2020; Wang et al., 2021)。很早之前的研究就表明低温特异Ca²⁺信号是低温应答基因表达的重要调控因子 (Knight et al., 1996)。然而，植物是如何接收并传递低温诱导的特异Ca²⁺信号还不清楚。

    6月29日，杨淑华教授团队在Science Advances杂志发表了题为“CPK28–NLP7 module integrates cold-induced Ca²⁺ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis”的研究论文，详细阐释了钙离子依赖型蛋白激酶CPK28和转录因子NLP7组成的调控网络在植物低温特异Ca²⁺信号的感知和传递中的作用 。

      植物中主要含有三类钙离子感知蛋白，包括钙调素蛋白 (CaM)、类钙调神经磷酸酶B蛋白 (CBL)和钙离子依赖型蛋白激酶 (CDPK/CPK) (Boudsocq et al., 2013)。其中，CPK蛋白既能结合钙离子又能通过其激酶域直接传递Ca²⁺信号 (Boudsocq et al., 2013)。因此，杨淑华团队从基因表达入手，分析CPK家族成员低温下基因表达差异。研究发现，CPK28基因受低温显著诱导表达。表型分析发现，CPK28功能缺失突变体表现冻敏感表型。有意思的是，植物经过低温处理10秒后，CPK28激酶活性被迅速诱导激活，该过程依赖于低温诱导的Ca²⁺信号。进一步研究发现，CPK28的Ca²⁺结合活性和激酶活性是其调控植物低温应答所必须的。以上结果表明，CPK28是植物感知低温钙信号的重要组分。

     CPK28定位于细胞质膜，因此猜测CPK28可能通过调控细胞膜或者细胞质中的蛋白传递低温Ca²⁺信号。为了验证这个猜测，杨淑华团队进行质谱分析并发现细胞质/细胞核定位的转录因子NLP7可能和CPK28存在于同一个蛋白复合体中。研究人员通过pull-down实验、免疫共沉淀实验验证两者存在相互作用。双分子荧光互补实验表明两者在细胞膜附近互作。进一步研究发现CPK28磷酸化NLP7并促进NLP7从细胞膜转移至细胞核中，该过程依赖于Ca²⁺。RNA-Seq结果表明，NLP7调控大量冷响应基因的表达，其中大约34%冷响应基因的表达依赖Ca²⁺。这些结果表明，NLP7作用于CPK28下游解码低温特异Ca²⁺信号并调控冷响应基因的表达。

      值得注意的是，NLP7是植物响应氮信号的关键转录因子。先前研究报道，CPK10、CPK30和CPK32在细胞核中磷酸化NLP7的第205位Ser，使NLP7在细胞核中滞留，进而激活氮应答基因的表达 (Liu et al., 2017)。杨淑华团队研究结果发现，低温激活的CPK28磷酸化NLP7的第783、793、807、808位Ser和第817位Thr，促进细胞质定位的NLP7迁移至细胞核中。NLP7^S205A(模拟氮条件下非磷酸化形式) 不能回复nlp7氮敏感表型，但是能回复nlp7冻敏感表型。然而NLP7^5A(模拟低温条件下非磷酸化形式) 不能回复nlp7冻敏感表型，但是能回复nlp7氮敏感表型。以上结果表明，氮信号和低温信号会通过不同的CPK蛋白磷酸化NLP7不同的氨基酸残基，从而使植物做出正确的应答。

图1 CPK28-NLP7介导植物感知和应答低温特异Ca²⁺信号的分子模型

      综上所述，该研究不仅解析了植物感知和应答低温特异Ca²⁺信号的分子机理，还阐释了低温信号快速从细胞膜传递至细胞核的分子机制。CPK28介导的磷酸化调控网络可能是植物感知低温早期信号的重要方式。

     该研究在中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室完成，丁杨林和杨浩为论文的共同第一作者，杨淑华和丁杨林为论文的共同通讯作者。杨淑华团队成员吴时凤、傅迪毅和李岷泽参与了该工作。本研究得到巩志忠教授的指导。本研究得到国家自然科学基金及国家重点研发计划的资助。

参考文献：

Boudsocq, M., and Sheen, J. (2013). CDPKs in immune and stress signaling. Trends Plant Sci. 18, 30-40.

Ding, Y.L., Shi, Y.T., and Yang, S.H. (2020). Molecular regulation of plant responses to environmental temperatures. Mol. Plant 13, 544-564.

Knight, H., Trewavas, A.J., and Knight, M.R. (1996). Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell 8, 489-503.

Liu, K.H., Niu, Y., Konishi, M., Wu, Y., Du, H., Sun Chung, H., Li, L., Boudsocq, M., McCormack, M., Maekawa, S., et al. (2017a). Discovery of nitrate-CPK-NLP signalling in central nutrient-growth networks. Nature 545, 311-316.

Liu, Q.B., Ding, Y.L., Shi, Y.T., Ma, L., Wang, Y., Song, C.P., Wilkins, K.A., Davies, J.M., Knight, H., Knight, M.R., et al. (2020). The calcium transporter ANNEXIN1 mediates cold-induced calcium signaling and freezing tolerance in plants. EMBO J. 40, e104559.

Wang, J., Ren, Y., Liu, X., Luo, S., Zhang, X., Liu, X., Lin, Q., Zhu, S., Wan, H., Yang, Y., et al. (2021). Transcriptional activation and phosphorylation of OsCNGC9 confer enhanced chilling tolerance in rice. Mol. Plant 14 315-329.

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn7901