植物病毒病害严重威胁全球农业生产和粮食安全，而植物病毒中有很大一类属于正义链RNA病毒。通常情况下，正义链RNA病毒在宿主细胞中的侵染可分为复制、病毒粒子组装、细胞内及细胞间移动等几个阶段，其中复制是病毒建立侵染的关键环节之一，该过程主要由病毒诱导细胞内膜重塑，形成病毒复制复合体(Viral replication complexes, VRCs)来完成。VRCs的形成是一个复杂而又高度有序的过程，需要众多宿主因子的参与。目前，用于鉴定参与VRCs形成的宿主因子的方法包括酵母双杂交 (Yeast two-hybrid, Y2H)和免疫共沉淀 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)结合质谱分析等，但由于VRCs组分的膜结合属性以及动态变化，上述方法用于鉴定VRCs组分方面仍存在着一定的局限性。

近年来，一种基于TurboID的邻近标记技术在鉴定互作蛋白方面受到越来越多的关注，该技术在鉴定瞬时、弱的或疏水性的蛋白互作方面显示出独特的优势(Zhang et al., 2019, Nature Communications; Yang et al., 2021, Plant Communications)。虽然该技术已用于一些动物病毒VRCs组分的鉴定中，但目前尚未有利用基于TurboID的邻近标记技术分析植物病毒VRCs的报道。

甜菜黑色焦枯病毒 (Beet black scorch virus, BBSV) 属于番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）乙型坏死病毒属 (Betanecrovirus)的正义链RNA病毒，在田间会引起甜菜黑色焦枯病，对我国及欧美的甜菜种植产业有严重危害。2015年Cao等报道BBSV能诱导内质网膜凹陷形成VRCs，并利用电镜三位重构技术对BBSVVRCs的空间结构进行了三维建模，这也是首例植物细胞中病毒VRCs三维结构的例子 (Cao et al., 2015, Journal of Virology)；此外，研究发现宿主因子Hsc70-2可直接参与BBSV的侵染 (Wang et al., 2018, Scientific Reports)；近期又有报道表明BBSV编码的外壳蛋白 (CP) 通过直接靶向植物14-3-3a蛋白抑制MAPK介导的抗病毒免疫 (Gao et al., 2022, Nature Communications)。但是，对于参与BBSV VRCs形成的宿主因子及其作用机制目前仍在很大程度上未知。

近日，中国农业大学生物学院张永亮课题组在Plant Cell在线发表了题为“RETICULON-LIKE PROTEIN B2 is a pro-viral factor co-opted for the biogenesis of viral replication organelles in plants”的研究论文。该研究利用基于TurboID邻近标记技术系统分析了BBSVVRCs的组成，鉴定到一个BBSV复制复合体的新组分—reticulon-like protein B2(RTNLB2)，并揭示了其在病毒复制工厂建成中的功能。

BBSV的复制辅助蛋白p23通过诱导ER膜重塑在BBSV VRCs形成中发挥关键作用。为了获得与p23邻近蛋白之间的功能联系，通过基于TurboID的邻近标记技术，鉴定到多个潜在的与p23互作的蛋白并构建了其互作网络。这些蛋白参与了内质网系统、转运系统（包括转运所需的内体分选复合物如ESCRT等）和蛋白质折叠系统等，暗示BBSV复制涉及到胞内的多个代谢通路和生物学途径，它们相互交错形成一个复杂的调控网络 (图1)。

图1. 利用邻近标记技术鉴定BBSV VRC组分及部分蛋白互作网络构建

在鉴定到的与p23邻近的185个蛋白中，RTN家族蛋白被高频富集，选择该家族中富集程度最高的RTNLB2作为研究对象。证明了其正调控BBSV的复制。机制分析表明，正常情况下，RTNLB2定位于ER，在诱导片层状ER向管网状ER转换以及ER管状结构维持中发挥重要功能 (图2, 左)。当BBSV侵染后，RTNLB2表达被诱导上调并被BBSV p23劫持，诱导ER膜重塑并使ER小管收缩，形成向内凹陷的泡状结构，最终形成BBSV VRCs (图2, 右)。

图2. RTNLB2促进BBSV VRCs组装的工作模型

总之，该研究以BBSV为研究模式，提供了基于TurboID邻近标记技术用于解析植物病毒VRCs组分的首个案例，加深了我们对内质网塑形蛋白在病毒VRCs形成中的功能的认识，为深入分析植物病毒与宿主互作提供了新的宿主因子组学数据，也为抗病毒作物遗传改良提供了潜在的靶点。

博士研究生张乾申、温智琰和已毕业的张馨博士为共同第一作者。中国农业大学生物学院张永亮教授为本论文的通讯作者。美国弗吉尼亚理工大学（Virginia Tech）的王晓峰教授、中国农业大学李大伟教授、李溱教授和苏震教授在实验设计、质谱鉴定和生物信息学分析方面为本研究做出了重要贡献。研究工作还得到了中国农大王献兵教授、于嘉林教授、韩成贵教授、王颖副教授和杨萌副教授的宝贵建议。此外, 南京师范大学的许凯教授、中国农科院植保所李方方研究员和中国农大郭泽建教授在质粒材料和技术方面提供了帮助和宝贵建议；美国弗吉尼亚理工大学的赵文浩博士和Janet Webster博士在实验技术和论文修改中给予了帮助，该研究由国家自然科学基金资助完成。

论文链接：

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koad146/7175287