2021年8月 16日，中国农业大学生物学院陈忠周教授在Virologica Sinica杂志上在线发表了题为“Structure and Function of N-Terminal Zinc Finger Domain of SARS-CoV-2 NSP2”的文章。

         SARS-CoV-2已成为威胁人类健康和安全的全球性流行病。随着新突变株的不断出现，寻找有效的治疗药物和靶点是当务之急。同时需要全面了解对SARS-CoV-2在宿主细胞中的分子基础和发病机制。Nsp2的结构和功能尚不清楚，这阻碍了我们对其在SARS-CoV-2感染中的作用的认识。在这里，我们报道了SARS-CoV-2 nsp2的N端晶体结构，分辨率为1.96 Å。这种新型结构包含三个锌指，分别属于C2H2、C4和C2HC型。结构分析表明，nsp2可能参与结合核酸和调节细胞内信号通路。与单链或双链核酸的结合主要通过nsp2表面的大正电荷区，K111、K112、K113是关键残基。我们的发现为更好地理解nsp2的结构和功能之间的关系奠定了基础。充分利用nsp2有助于进一步研究和开发抗病毒靶点和药物设计。

        Nsp2_1-276和nsp2全长蛋白的表达如图1A所示。通过SAD方法和COOT人工建模结合REFMAC5的细化，最终得到空间群为P2₁、分辨率为1.96 Å的nsp2_1-276结构，Rwork为19.97%，Rfree为22.56%(表1)。

表1. SARS-CoV-2 nsp2_1-276数据收集和优化信息统计

        Nsp2_1-276的结构是由四链组成的非对称单元，整体构象为四叶三叶草(图1B)。A链与B链对称，C链与D链对称。每条链包含10个α-螺旋(α1 -α10)和14个β层(β1 -β14)，其中3个锌指(ZnF)构成一个完整的结构域(图1C)。每条链上有三个锌原子，排列成对称的三角形。位于α1的 Cys20、以及位于loop的Cys51、His54和His56中的侧链结合锌离子，形成经典的C2H2锌指结构(ZnF1 (图2A)。由Cys143、Cys146、Cys161和Cys165组成的ZnF2属于C4型锌指，4个反向的β片层与Zn2嵌套在内部形成钳夹结构(图2B)。在β11， α8和β13中，Zn3离子分别与三个半胱氨酸(C190, C193, C236)和一个组氨酸H202环路进行四面体配位，形成C2HC型锌指结构(图2C)。

图1. nsp2的总体结构

图2. 三个锌指结构的特写视图

        nsp2_1-276整体结构由四条链组成， 那么在溶液中的低聚态是单体还是四聚体？我们进行了凝胶过滤分析和小角度x射线散射(SAXS)实验来分析nsp2_1-276在溶液中的在溶液中的聚集状态。结果表明它在溶液中是单体(图3)。

图3. nsp2_1-276在溶液中的聚集状态分析

         Nsp2的生化功能尚不清楚。为了揭示它，我们进行了结构分析。nsp2的静电表面存在一个较大的正电荷区域(图4A)。

图4. Nsp2具有较大的正电荷区域

        因此，我们假设nsp2表面的正电荷区域参与了核酸的结合。由于nsp2不仅可能参与病毒的复制和转录，还可能影响宿主基因组，抑制宿主蛋白的合成。我们推测nsp2可能与ssDNA或dsDNA相互作用。EMSA检测结果显示，nsp2全长和nsp2_1-276均能与ssDNA或dsDNA结合，且蛋白浓度越高，复合带越明显(图5A-图5D)。有趣的是，ZnF1、ZnF2和ZnF3并不是带正电荷最多的区域(图4B)。因此，我们使用不同浓度的EDTA (0 ~ 200 mmol/L)螯合Zn2+离子破坏ZnF结构，发现200 mM EDTA仍然不能影响蛋白质和DNA的相互作用(图5E)。结果表明，三个锌指不直接参与核酸的结合。同时，我们发现三个带正电荷的赖氨酸(K111/K112/K113)位于突出位置(图4A)。当三个连续带正电的赖氨酸(K111/K112/K113)突变为不带正电的丙氨酸时，没有观察到结合条带(图5F)。因此，我们可以得出结论，nsp2与核酸的相互作用依赖于带正电荷的表面的大面积区域，而K111、K112和K113残基是关键位点。

图5. nsp2与DNA的结合

        综上所述，nsp2 N端结构是全面了解SARS-CoV-2 nsp2结构-功能关系的第一步。针对SARS-CoV-2全球大流行，我们的研究结果对于充分利用nsp2作为进一步开发抗病毒靶点和药物设计具有重要意义。

        该文章陈忠周教授为论文通讯作者，博士研究生马俊为本文的第一作者。吴玮副教授为共同作者，陈依芸也参与了本研究的工作。本研究得到了国家重点研发计划项目(2018YFE0113100)和国家自然科学基金项目(31872713)的资助。