11月24日，《国际微生物生态学会会刊》（the ISME Journal）在线发表了我院根瘤菌研究团队田长富教授课题组的研究论文：《细胞内同质园揭示细菌适应性演化过程中转座元件群落的生态位分化》（Intracellular common gardens reveal niche differentiation in transposable element community during bacterial adaptive evolution）。该研究针对耐盐碱的广宿主费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii），基于生态学共性原理构建了细胞内“同质园”，发现外源基因在多复制子根瘤菌底盘的突变频率依赖外源基因的GC含量及其所在的复制子，这种突变频率的差异主要是由不同转座元件的生态位分化造成的——其中外源基因沉默蛋白MucR在转座元件群落的生态位分化中扮演了重要角色。

根瘤菌-豆科植物共生固氮体系是自然界效率最高的生物固氮类型，在全球氮素循环和农业的可持续发展中发挥着重要作用。但是已有商业根瘤菌剂的接种效果不稳定，会受到豆科作物品种、土壤条件与田间管理措施的显著影响——如何获得广谱性抗逆高效根瘤菌是该领域合成生物学研究的难题。近年来，田长富教授课题组针对耐盐碱的快生型大豆根瘤菌开展了系统的泛基因组及结瘤固氮效率演化的遗传与分子生物学机制研究：1）解析了调控结瘤固氮效率的一系列保守的或菌种特异的基因模块与线路（mBio 2022a, 2022b, 2020; mSystems 2021; PLoS Genetics 2018; Environmental Microbiology 2017），发现可转座插入序列（ISs）在三型分泌系统（T3SS）及其效应蛋白NopP编码基因的插入突变介导了不匹配菌株共生匹配性的快速适应性演化（ISME J 2018）；2）揭示了趋同演化的外源基因沉默蛋白MucR在结瘤固氮功能与根瘤菌底盘适配优化中的全局性调控机理（Nucleic Acids Research 2022; ISME J 2022a; mBio 2021）。为了进一步解析外源基因在根瘤菌底盘的遗传稳定性决定机制从而指导根瘤菌合成生物学改造的理性设计工作，田长富课题组基于生态学共性原理，构建了细胞内生态学实验体系（表1），结合实验进化学和分子生物学方法开展了该项研究工作。

表1. 转座元件的细胞内生态学与经典生态学对应表

该研究设计获得了同义密码子GC含量不同的外源条件性不利基因sacB（L-GC、M-GC和H-GC），将它们分别插入广宿主费氏中华根瘤菌基因组中的三个复制子（pA、pB和Ch），获得了9个细胞内“同质园”，然后在10%蔗糖选择压力下开展实验进化学研究，得到了一系列sacB突变克隆（基因丢失、大片段插入突变、SNP或短InDel）；sacB的突变频率与其GC含量和所插入的复制子相关——其中，不同ISs可以跨复制子转座插入这些sacB同质园，但转座插入效率存在显著差异（图1；主要ISs包括Set_ID12、16、8等）；进一步的生态位分化分析表明9个sacB同质园的GC含量、各ISs的可插入位点数目、SacB酶活性是影响ISs插入频率的主要变量——在实验进化过程中，细胞内不同ISs的生态位分化首先发生在这些变量控制的维度（与OMI1之间的夹角约15度），各复制子的GC含量及ISs拷贝数则从另一个维度对生态位的进一步分化产生影响（与OMI2之间的夹角约30度）（图2）。

图1. 外源基因的遗传稳定性具有GC含量及复制子依赖性——ISs转座效率存在差异

值得注意的是，发挥主要作用的三个ISs存在生态位的部分重叠（Set_ID12、16和8），位于共生质粒pA的外源sacB同质园更容易被这些ISs插入（但插入效率和热点存在差异；图1和图2），而外源基因沉默蛋白MucR偏好靶向共生质粒pA的DNA并具备桥连DNA的能力（Nucleic Acids Research 2022; ISME J 2022a）。该研究进一步探索了MucR在ISs生态位塑造中的潜在作用：ChIP-qPCR和DNA桥连实验等证明MucR能够靶向并桥连外源sacB同质园的多个DNA片段；在mucR缺失突变株的共生质粒pA构建sacB同质园，发现Set_ID12和Set_ID16在同质园中的插入频率降低而Set_ID8的插入频率上升（图2）；此外，野生型出发菌株能够通过ISs转座插入pA上的T3SS及其效应蛋白NopP编码基因获得共生匹配性的快速演化（ISME J 2018），而mucR缺失突变株几乎丧失了这个适应性演化能力（图2）。

该研究在实验进化学背景下，通过构建细胞内同质园研究外源基因序列特征及基因组插入位置对其遗传稳定性的影响，对根瘤菌等细菌底盘的合成生物学改造具有重要指导意义；同时该研究利用细菌代时短的特点，以构建细胞内同质园的方式，研究基因组生态学中转座元件的分布和多度形成机制，对基因组生态学从描述性的相关性研究过渡到因果关系研究具有引领作用。

图2. 不同插入序列(ISs)的转座效率与生态位分化——部分依赖外源基因沉默蛋白MucR

我院根瘤菌研究团队田长富教授为该研究论文的通讯作者，郭会博士为第一作者，已毕业博士研究生石文涛和张碧亮、在读博士生许彦惠及焦健副教授为共同作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、农业生物技术国家重点实验室自主研究课题、中国农业大学“2115人才培育发展支持计划”（青年科学家创新团队）等项目的支持。

论文链接： https://www.nature.com/articles/s41396-022-01344-2