2021年9月，中国农业大学生物学院动物生理系在Cell Proliferation杂志上在线发表了题为“Mitochondrial Calcium uniporters are essential for meiotic progression in mouse oocytes by controlling Ca²⁺ entry”的研究文章。

大量的研究表明, 卵母细胞中的线粒体功能异常会造成减数分裂异常和胚胎发育缺陷。在细胞的多种生命活动中Ca²⁺作为第二信使起着信号传导的作用, 卵母细胞中Ca²⁺更是直接参与成熟、受精和早期胚胎发育。线粒体是生殖细胞中至关重要的细胞器, 其功能对能量状态具有双重影响。线粒体产生ATP和ROS, 它们是氧化磷酸化的天然副产物。这两种化合物都可以调节和控制生物过程, 调节细胞传导。先前的研究表明, 线粒体具有典型的母系遗传特征, 其中母系遗传的线粒体会全部遗传给后代, 因此, 保持卵母细胞的线粒体功能对于生殖的重要性更加毋庸置疑。

本实验根据减数分裂过程中的纺锤体的定位和染色体的聚集情况, 将卵母细胞减数分裂成熟过程分为GV期, GVBD期, M1期, A1期, T1期, M2期 6个时期。分别取6个时期的卵母细胞, 通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测其线粒体Ca²⁺和ATP水平。统计数据发现, 卵母细胞线粒体钙水平随着减数分裂成熟进程发生着变化, 且不同时期的线粒体钙水平和ATP水平的变化趋势相一致。说明线粒体钙稳态在卵母细胞成熟分裂进程中起着至关重要的作用。

图1 线粒体钙与ATP水平在卵母细胞成熟过程中的变化趋势

线粒体通过氧化磷酸化调节ATP的产生, 且钙信号在调节细胞周期中发挥重要作用。然而, 关于能量的感知和能量依赖的细胞过程(如减数分裂)之间的联系知之甚少。本实验在小鼠卵母细胞中建立了一个模型, 使用siRNA敲除靶向线粒体Ca²⁺单向传递体(MCU), 以抑制线粒体Ca²⁺浓度。通过建立一个这样的线粒体钙缺失模型来探究低钙条件下卵母细胞减数分裂的发生情况和可能造成卵母细胞质量异常的机制等。

为研究MCU在减数分裂过程中的功能, 本实验对GV期卵母细胞使用了特定的siRNA 干扰序列进行显微注射, 通过敲降MCU通道蛋白使线粒体钙吸收变少, 建立线粒体钙降低模型。为检测干扰序列的敲降效率, 取敲降后的卵母细胞进行免疫荧光染色, 本研究使用共聚焦成像后使用软件 NIS-Elements AR 定量统计其荧光强度分析结果, 敲降MCU的卵母细胞MCU蛋白表达显著降低

图2 敲降MCU建立线粒体低钙模型

本实验对敲降敲降MCU后的卵母细胞进行了成熟率检测。发现MCU导致卵母细胞的GVBD发生率显著降低, 第一极体排出率显著降低。以上结果说明敲降MCU会影响小鼠卵母细胞成熟。

通过对MI和MII两个时期的小鼠卵母细胞进行Tublin免疫荧光染色实验, 本研究发现和对照组相比, 敲降MCU组的MI期和MII期卵母细胞中的纺锤体缺陷比例显著升高。

图
3线粒体低钙会造成卵母细胞纺锤体装配异常

通过前边的研究结果, 本研究已知线粒体Ca²⁺降低会导致延缓减数分裂成熟异常, 但造成其成熟异常的机制尚不清楚。为了探究线粒体钙水平降低对卵母细胞成熟影响的机制, 本研究利用RNA-seq技术对对照组, 敲降MCU两组进行了基因表达水平的检测。本研究利用基因本体论 (Gene Ontology, GO) 分析发现, 失调基因显示了一些生物过程的异常表达。特别是在GO富集下调基因的分析中, 本研究发现细胞的代谢过程发生了明显的改变, 这可能会降低卵母细胞的能量合成。此外, 本研究注意到生殖发育进程、肌动蛋白-细胞骨架组织和线粒体发育进程也有负调控, 这表明某些影响卵母细胞质量的关键因素受到了破坏。因此, 所有这些途径或生物过程都与能量代谢、氧化应激线粒体功能密切相关, 这促使本研究关注MCU缺失的卵母细胞线粒体和能量感应之间的关系。

图4对照组与敲降组的差异表达基因Go富集分析

为了证实ATP在减数分裂过程中是不可或缺的, 本实验在成熟液中添加5 μm的外源ATP, 观察到MCU缺失后卵母细胞的减数分裂恢复情况。实验结果表明, 外源添加ATP处理后, MCU敲降引起的减数分裂缺陷可以得到明显改善。这些结果说明MCU会通过维持正常的ATP水平来调控减数分裂。接下来, 本研究试图探究MCU缺陷对减数分裂成熟和线粒体功能的影响机制, 以解释前面所展示的表型。从GO富集分析中, 本研究注意到一些上调基因集中在AMPK信号中。由于低ATP水平可激活较低的AMPK活性, 本研究通过带有免疫荧光标记的抗体在GV期卵母细胞中表达p-AMPK。与假设相一致, 在MCU缺失的情况下, 卵母细胞中p-AMPK的表达显著上调

图5线粒体钙水平降低造成小鼠卵母细胞AMPK信号通路异常激活

综上，该研究的结果证明了MCU依赖的线粒体Ca2+信号通路的关键作用, 将能量传感与适当的减数分裂进程和AMPK磷酸化连接起来。当卵母细胞因缺失MCU而造成线粒体功能受损时, 胞质ATP水平下降。能量传感器AMPK被激活和磷酸化, 以响应增加的能量应激。AMPK的过度激活则会对减数分裂的恢复产生不利影响。此外, 微管动力不足导致纺锤体形成异常, 导致减数分裂进程的降低。该研究首次揭示线粒体钙降低与减数分裂进程的影响, 同时证明了MCU蛋白在卵母细胞中的重要性。

该文章中国农业大学生物学院动物生理系侯云鹏副教授为论文通讯作者，博士研究生张璐瑶和孟琳为本文的共同第一作者。中国农业大学生物学院本科生王梓川，中国农业大学动物科技学院颛清芮，动物生理系研究生李俊进和刘克雄也参与了该研究工作。该研究得到了国家转基因育种生产重大专项资助（2016ZX08007-002），感谢中国农业大学傅祥伟副教授对文章给予指导。