2020年12月 15日，中国农业大学生物学院动物生理系在Frontier in cell and developmental biology杂志上在线发表了题为“Mitochondrial Ca²⁺ Overload Leads to Mitochondrial Oxidative Stress and Delayed Meiotic Resumption in Mouse Oocytes”的研究文章。

线粒体在卵母细胞中的含量丰富, 它通过氧化磷酸化产生ATP, 为卵母细胞成熟过程中的纺锤体迁移和染色体分离, 以及胚胎有丝分裂启动后的蛋白合成和细胞分裂提供能量。线粒体Ca²⁺作为卵母细胞内三大钙库之一的“快Ca²⁺库”维持胞内钙稳态的动态平衡。此外, 在多种细胞中线粒体Ca²⁺被发现对ATP合成, 细胞自噬, 细胞凋亡均有调控作用。

线粒体Ca²⁺调控细胞中的多个生物学过程, 线粒体Ca²⁺的异常积累可能改变线粒体的形态、氧化还原状态和ATP合成情况等。然而目前的研究尚不清楚线粒体Ca²⁺超载是否与肥胖、糖尿病或老龄小鼠卵母细胞的质量异常有关。线粒体Ca²⁺超载在调节卵母细胞质量和减数分裂成熟中的作用尚不清楚。为探究线粒体Ca²⁺超载对卵母细胞质量的影响机制，该研究建立了两种小鼠卵母细胞线粒体钙超载模型:(1) 敲降Micu1或Micu2; (2) 敲降NCLX。该研究希望借助这些模型可以确定线粒体钙超载对卵母细胞成熟的影响, 以及是否可以通过降低线粒体Ca²⁺浓度来改善受损的卵母细胞线粒体功能。

图1. 线粒体钙超载模型的建立

该研究使用DCFHDA 活性荧光染料标记 ROS，结果分析显示，敲降Micu1/2 和NCLX组卵母细胞荧光强度较高。为更准确的对卵母细胞内的ROS水平进行定量分析, 该研究使用ROS Elisa检测试剂盒分别为对照组和敲降组的卵母细胞进行ROS含量的检测。结果显示, 敲降Micu1/2 和NCLX后的卵母细胞内ROS 水平显著提高, 定量分析统计学上差异显著说明线粒体钙超载导致卵母细胞产生过多的 ROS。接下来, 该研究检测了敲降Micu1/2 和NCLX组卵母细胞氧化应激和线粒体功能相关基因的表达水平, 发现 Sod1, Sdha, Ndufs3 等基因 mRNA 水平显著下调说明线粒体钙超载扰乱了卵母细胞内的氧化还原动态平衡。以上结果表明, 线粒体钙超载导致卵母细胞产生过多 ROS, 进而加剧氧化应激。

图2线粒体钙超载会加剧卵母细胞氧化应激

该研究团队之前的研究表明, Ca²⁺水平紊乱会造成猪和牛卵母细胞的成熟异常。该研究对显微注射后的不同组卵母细胞进行了体外成熟培养, 并分别于2.5h和12h后统计GVBD发生和PB1的排出情况。统计结果发现， 敲降Micu1/2 和NCLX 后的卵母细胞GVBD发生率和PB1的排出率均显著下降。GVBD是指卵母细胞细胞核的溶解, 是卵母细胞成熟的指标。GVBD的发生表明卵母细胞减数分裂的恢复, 而PB1的排出则表明第一次减数分裂的完成;卵母细胞在减数分裂第二次分裂中期, 即受精前停止。因此, 通常用GVBD和PBE来评价卵母细胞成熟的质量。以上结果表明, 线粒体钙超载会对卵母细胞成熟造成影响。

图3线粒体钙超载会影响卵母细胞成熟

为了探究线粒体钙水平升高对卵母细胞成熟影响的机制, 该研究利用RNA-seq技术对对照组, 敲降Micu1/2和敲降NCLX三组进行了基因表达水平的检测。测序结果说明线粒体钙超载会对卵母细胞许多基因的表达产生影响，为进一步了解这些差异基因的生物学功能, 对差异基因进行KEGG Pathway富集和功能通路分析。通过KEGG富集分析的比较, 还可以发现敲降Micu1/2和敲降NCLX有很多相似的差异通路富集。该研究通过KEGG通路分析和对相关基因进行的荧光定量PCR检测, 发现一些属于cAMP-PKA信号通路的基因，如Rela,Tiam1,Slc9a,Pi3kcd,Map2k2在敲降Micu1/2和敲降NCLX的卵母细胞中发生了表达异常。

图4 线粒体钙超载通过PKA/cAMP信号通路影响卵母细胞成熟

综上, 该研究一系列的结果表明, 适当的线粒体Ca²⁺调节对维持线粒体功能和卵母细胞成熟至关重要。肥胖可能导致与线粒体Ca²⁺稳态调节相关的MICU1/2表达受损。在这项研究中, 证明了适当的调节线粒体Ca²⁺在肥胖模型恢复卵母细胞线粒体基因表达和改善线粒体活性。该研究为研究人员能够从肥胖、衰老等模型中找到解决卵母细胞线粒体功能障碍提供可靠途径, 并为改善缺陷卵母细胞发育和改善女性生殖提供新的思路。

该文章中国农业大学生物学院动物生理系侯云鹏副教授为论文通讯作者，博士研究生张璐瑶为本文的第一作者。中国农业大学生物学院本科生王梓川和动物生理系研究生逯腾飞、孟琳和罗燕也参与了该研究工作。该研究得到了国家转基因育种生产重大专项资助（2016ZX08007-002），感谢中国农业大学傅祥伟副教授对文章给予指导。