2022年5月 21日，中国农业大学生物学院动物生理系在Oxidative Medicine and Cellular Longevity杂志上在线发表了题为“Mitochondrial calcium disorder affects early embryonic development in mice through the ERK/MAPK signaling pathway.”的研究文章。

线粒体在卵母细胞中的含量丰富, 它通过氧化磷酸化产生ATP, 为卵母细胞成熟过程中的纺锤体迁移和染色体分离, 以及胚胎有丝分裂启动后的蛋白合成和细胞分裂提供能量。线粒体Ca²⁺作为卵母细胞内三大钙库之一的“快Ca²⁺库”维持胞内钙稳态的动态平衡。此外, 在多种细胞中线粒体Ca²⁺被发现对ATP合成, 细胞自噬, 细胞凋亡均有调控作用。

高质量的卵母细胞是后续胚胎发育成功与否的先决条件, 并为生命的起源提供物质基础。线粒体是哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中最丰富、最重要的细胞器。先前的研究也表明, 线粒体具有典型的母系遗传特征。此外, 它们还是持生殖过程的主要细胞能量来源。

本研究分别在卵母细胞成熟培养基中添加MCU激活剂和抑制剂, 使GV期卵母细胞体外成熟。如图1 A-B所示,本研究使用Rhod-2 AM通过共聚焦激光扫描显微镜分析线粒体Ca²⁺水平。MCU激活剂精胺处理MII期卵母细胞后线粒体Ca²⁺水平显著升高, 而MCU抑制剂Ru360处理则相反。然后用Flou-3 AM和Mag Flou-4 AM分析细胞质Ca²⁺和内质网Ca²⁺。如图1C-F所示, 定量分析显示, 处理后的卵母细胞中Flou-3 AM强度和Mag Flou-4 AM强度的相对均值与对照组无显著差异。

图1线粒体钙水平紊乱模型中各个钙库的Ca²⁺水平

本研究通过孤雌激活探究线粒体钙紊乱对MII卵母细胞的胚胎发育能力的影响 (图2A)。如图3-45 B所示，孤雌激活后的统计结果表明, 大多数对照MII卵母细胞可以被激活并发育成2-cell 胚胎, 而经过处理的MII卵母细胞与对照相比, 原核形成显著降低。此外, 添加精胺或Ru360有效地降低了2-cell胚胎、4-cell 胚胎, 桑椹胚和囊胚发生率 (图2 A, C-F)。本研究进一步监测了激活卵母细胞随后的早期胚胎发育, 发现线粒体钙紊乱显著降低了激活卵母细胞囊胚形成率。

图2对照组、精胺处理组和Ru360处理组孤雌激活各阶段胚胎率

本实验对对照组和处理组MII卵母细胞用α-Tublin荧光素 (FITC) 抗体染色观察纺锤体形态, 并用DAPI复染色观察染色体。结果表明, 与对照组相比, 精胺处理组和Ru360处理组的MII期卵母细胞纺锤体装配异常的比例显著升高, 说明线粒体钙紊乱会造成MII卵母细胞纺锤体装配异常 (图3A-B)

图3 对照组、精胺处理组和Ru360处理组纺锤体装配情况

既往研究表明, ATP和ROS伴随着TCA循环在线粒体中同时产生, 代谢紊乱导致DNA甲基化及表观遗传修饰的改变。接下来本实验使用荧光实时定量PCR检测Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达。分析实验结果发现, 在不同胚胎期, 精胺处理组和Ru360处理组卵母细胞Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表达均显著低于对照组 (图4 A-E)。总之, 这些结果表明, 线粒体钙紊乱延迟了它们随后的胚胎发育, 并影响MII 卵母细胞DNA甲基化转移酶相关基因的表达。

图4 线粒体钙紊乱对DNA甲基化转移酶相关基因表达的影响

结合本研究前期关于GV卵母细胞低线粒体Ca²⁺和线粒体Ca²⁺超载模型的RNA-seq数据研究表明, MAPK信号在低线粒体Ca²⁺模型中下调, 而在线粒体Ca²⁺超载模型中表达上调 (图5 A-B)。本研究对三组卵母细胞ERK/MAPK通路上的相关基因进行了实时荧光定量PCR验证分析, 发现ERK/MAPK通路相关基因在精胺处理的卵母细胞中表达显著上调, 而在添加Ru360的卵母细胞中表达显著下调(图6 A-H)。

图5 线粒体钙紊乱对卵母细胞影响机制的GSEA分析

图6 对照组与处理组的差异表达基因实时荧光定量PCR验证分析

综上, 该研究一系列的结果表明, Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b会造成印记基因的异常遗传和甲基化异常表达, 影响胚胎发育。结合结果中发现的MII期卵母细胞中5mC水平的降低, 本实验认为线粒体钙水平紊乱改变了表观遗传修饰, 继而会影响后续胚胎期的卵母细胞激活。然而, MAPK信号通路与线粒体钙紊乱导致的表观遗传异常之间的关系却鲜为人知。以往的研究为ERK/MAPK信号通路参与小鼠大脑的表观遗传调控提供了证据, 说明ERK/MAPK信号通路的确可能参与到表观遗传调控中来。值得注意的是, U0126处理精胺补充的卵母细胞或用IGF1处理Ru360补充卵母细胞或囊胚后, 免疫荧光标记的抗体定量表达5mC的结果显示, 如预期的那样, U0126或IGF1挽救了治疗组中5mC的表达缺陷。这些结果表明, 线粒体Ca²⁺紊乱导致MAPK信号异常, 从而引起卵母细胞表观遗传修饰的改变。

该文章中国农业大学生物学院动物生理系侯云鹏副教授为论文通讯作者，博士研究生张璐瑶为本文的第一作者。中国农业大学生物学院动物生理系研究生刘克雄，刘志强，孟琳，中国农业大学生物学院动物繁殖与发育系研究生颛清芮也参与了该研究工作。该研究得到了国家转基因育种生产重大专项的资助，授权号:32072736，感谢中国科学院西北高原生物所贾功雪副研究员和中国农业大学傅祥伟副教授对文章给予指导。