钾离子（K⁺）是植物维持自身生长发育所必需的矿物质营养元素，在植物细胞的基本生命过程以及植物响应逆境胁迫中起着至关重要的作用，例如渗透压、膜电位调节、气孔开闭、光合作用、蛋白质合成等¹。AKT1是介导拟南芥根细胞从土壤中吸收钾离子的重要通道。基于AKT1的重要功能，其活性受到严格的调控。AKT1在静息状态下活性很低，受到低钾刺激后，可被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CIPK23以及B样钙调磷酸酶CBL1/9信号通路磷酸化激活²。此外，AKT1可以与α亚基AtKC1形成异源四聚体抑制通道的钾离子转运活性，防止钾离子的渗漏³。然而，AKT1活性如何受到上述细胞过程调节，从而发生活性状态变化的机制尚不清楚。

2022年9月27日，我院杨光辉课题组与王毅课题组在Nature Communications杂志上发表了题为Structural basis for the activity regulation of a potassium channel AKT1 from Arabidopsis的文章。通过解析拟南芥钾离子通道AKT1处于静息活性和磷酸化激活两种状态的结构，以及AKT1持续激活突变体和AKT1-AtKC1复合体的结构，揭示了揭示植物根细胞吸收钾离子的分子机制、AKT1处于不同活性状态下的构象差异、不同构象的状态之间转换的分子机制，为提高植物的钾离子利用效率提供重要理论基础，也为靶向调节AKT1活性进行分子育种提供了科学依据⁴。

作者通过非洲爪蟾卵母细胞进行双电极电压钳记录检查AKT1的通道活性。与先前的研究一致²，由K⁺内流产生的AKT1电流需要CIPK23和CBL1的存在（图1a）。在体外重组表达AKT1并制备冷冻样品，解析出了处于低活性状态下的结构（图1b）。与其他已发现的动植物钾离子通道不同，AKT1在胞质一侧呈现二重对称。从结构中可以得到，AKT1同源四聚体由两种构象不同的AKT1单体组成，二者之间的差异具体体现在C-linker中B’C’螺旋的弯折状态（图1c）。除此以外，仅在Mol I/I’的近 平直C-linker上方存在较短的N端螺旋结构loop 1/1’，而不存在于Mol II/II’。由此，作者猜测由loop 1/1’存在所引起的空间位阻是Mol I/I’的C-linker无法弯折的原因。

图1 AKT1处于静息状态下的结构

为了探究磷酸化激活机制，作者将AKT1与CIPK23和CBL1共表达，并纯化用于冷冻电镜研究，发现在磷酸化的AKT1胞内区存在额外的四重对称结构（图2a）。通过质谱鉴定，确认了AKT1的磷酸化位点。与单独的AKT1相比，Ser26和Ser338在与CIPK23和CBL1共表达后被磷酸化，同时Ser338恰好位于C-linker弯折处（图2b）。电生理实验表明，对Ser26和Ser338进行模拟磷酸化突变后，AKT1不需要被CIPK23-CBL1磷酸化激活，即具有钾离子通道活性（图2c）。以上数据，表明磷酸化AKT1可能会使C-linker发生构象变化，从而自二重对称的静息状态转变为四重对称的激活状态。

图2 磷酸化状态激活状态下的AKT1及其磷酸化鉴定

为了验证胞内区对称性的构象变化是由通道活性变化引起的，作者在二重对称作用界面上引入突变体，试图通过改变AKT1的构象从而使通道处于自激活状态。经过电生理实验的验证，作者确认了在对称界面引入突变，可以使AKT1在没有激酶的情况下发挥钾离子通道活性。结构研究表明，自激活突变体AKT1-D379A处于与大多数钾离子通道类似的四重对称的结构，且其C-linker均处于弯折状态（图3a）。在该构象下，C-linker上方无loop1/1’电子密度。

为了进一步研究AKT1的构象与活性之间关系，作者对AKT1/AtKC1复合体的结构进行了解析。不出所料，AKT1/AtKC1复合体的胞内一侧显示出二重对称构象，整体结构与静息状态下的AKT1非常相似（图3b）。值得注意的是，复合体中AtKC1的C-linker呈现类似于AKT1 Mol I/I'的近 平直构象，而AKT1的C-linker表现出Mol II/II'的典型弯折构象（图3c）。

图3 AKT1 D379A与AKT1/AtKC1复合体结构间的比较

综上，作者解析了拟南芥钾离子通道AKT1处于静息活性和磷酸化激活两种状态的结构，以及AKT1组成型活性突变体和AKT1/AtKC1复合体的结构，揭示了AKT1处于不同活性状态下的构象差异、不同构象的状态之间转换的分子机制，发现了磷酸化AKT1会使C-linker发生构象变化，从而自静息状态下的二重对称的转变为激活状态下的四重对称，而AtKC1与AKT1形成胞内区为二重对称的异源四聚体，因此作者认为AKT1存在这种特有的活性相关的对称性变化——低活性状态下在胞质一侧呈现二重对称；高活性状态下，胞内区由二重对称转变为四重对称。但是本篇文章的研究仍然有一定的局限性，AKT1的C端ANKs结构域在CIPK23-CBL1磷酸化过程中发挥重要作用，但由于该区域柔性较强，这些结构域在该工作中无法被清晰观察到。

我院博士研究生卢亚明、于淼、贾雨田为本文共同第一作者，博士研究生杨帆、张延明、徐瑕参与了该工作，我院杨光辉教授、王毅教授为本文的共同通讯作者。清华大学雷建林老师、李晓敏博士、杨帆博士和刘涛在冷冻电镜数据收集给予了帮助。清华大学冷冻电镜平台为本研究提供了设备和技术支持。该研究得到了国家重点研发计划(2020YFA0509902)，国家自然科学基金（32171188，32161133014），中国高校基本科研业务费（2020RC008，2020TC177，2021RC012，2022RC017），中国农业大学分子设计育种前沿科学中心青年科学家探索项目（2022TC144），以及中国科协青年人才托举工程的资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-33420-8

参考文献

1 Wang, Y. & Wu, W. H. Plant Sensing and Signaling in Response to K⁺-Deficiency. Mol Plant 3, 280-287, doi:10.1093/mp/ssq006 (2010).

2 Xu, J. et al. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K⁺ transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell 125, 1347-1360, doi:10.1016/j.cell.2006.06.011 (2006).

3 Wang, Y., He, L., Li, H. D., Xu, J. A. & Wu, W. H. Potassium channel alpha-subunit AtKC1 negatively regulates AKT1-mediated K⁺ uptake in Arabidopsis roots under low-K⁺ stress. Cell Res. 20, 826-837, doi:10.1038/cr.2010.74 (2010).

4 Lu, Y. et al. Structural basis for the activity regulation of a potassium channel AKT1 from Arabidopsis. Nat Commun 13, 5682, doi:10.1038/s41467-022-33420-8 (2022).